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Análisis de control metabólico

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clase de bioquímica online AO1
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Oaxaca: Más allá de la insurrección. Crónica de un movimiento de movimientos (2006-2007) pdf

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2013
de enzimas




Analisis de Control
Metabolico:un estudio

cuantitativo del
metabolismo de enzimas

Software educativo 1
Brizi Maria Cecilia
Gonzalez Y Rivas Melania Lilia
Mangialavori Irene Cecilia
Gonzalez De La Rosa Adys


Grupo Software educativo 1-AO1

Recursos didacticos


Recurso web
Estaran incluidos todos los links a paginas, sitios webs, etc., que permitiran al
estudiante ampliar el tema propuesto y diversificar los canales de asimilacion
del contenido.

Definicion
Resaltara las definiciones clave propuestas en la clase.



Cita
Reunira las citas de autores incluidos en la bibliografia del tema tratado.



Para recordar
Sistematizara los conceptos esenciales de cada tema.




Para pensar?



Brizi Maria Cecilia-Gonzalez Y Rivas Melania Lilia-Mangialavori Irene Cecilia-Gonzalez De La Rosa Adys



Grupo Software educativo 1-AO1


Indice




Introduccion


Analisis de Control Metabolico


Actividad para el Foro??? Lo sacamos?


Material Complementario

Cuestionario con respuestas para el software de evaluacion

Glosario

Bibliografia





















Brizi Maria Cecilia-Gonzalez Y Rivas Melania Lilia-Mangialavori Irene Cecilia-Gonzalez De La Rosa Adys



Grupo Software educativo 1-AO1
Objetivos

La clase esta dirigida a estudiantes universitarios de la carrera de Bioquimica (4ano).
Su implementacion facilita la asimilacion del contenido mediante un lenguaje cercano y
motivador pese a la complejidad del tema. Los recursos utilizados permiten la
sistematizacion de contenidos anteriores, su vinculacion con los nuevos elementos que se
plantean al estudiante, la ampliacion del tema a traves de links externos que muestran
variedad de criterios e ilustran el tema que abordamos de manera dinamica.

Contenidos del programa

La clase esta disenada para que el estudiante vaya elaborando los contenidos. El
estudiante es guiado y el mismo ira deduciendo el camino que se le propone o buscando
alternativas que lo enriquezcan. Al inicio se enumeran una serie de recursos que el
alumno encontrara y utilizara en la clase. La actividad final, disenada exclusivamente para
la clase, permite que el estudiante calcule y encuentre sus propios resultados a partir de
los datos que introduzca en el Excel. De esta manera, el podra evaluar su comprension y
sistematizar los contenidos. A esto se suma la interaccion en el foro con el profesor y el
resto del aula para intercambiar sobre el tema.
Comentario [p1]: Chicas, esto es una

propuesta para darle forma porque no se
mucho del tema, espero sirva.



INTRODUCCION

A partir del descubrimiento de Eduard Buchner (c. 1900) de que un extracto de celulas de
levadura podia convertir glucosa en etanol y CO2, un eje fundamental de la investigacion
bioquimica fue de deducir los pasos por los que se producia esta transformacion y
caracterizar cada una de las enzimas que los catalizaban.
A mediados del siglo XX, las diez enzimas de la via glucolitica habian sido
purificadas y caracterizadas. En los proximos 50 anos se ha aprendido mucho sobre la
regulacion de estas enzimas. La sabiduria convencional era que en una via metabolica
lineal (tal como la glucolisis, la enzima de la via cuya velocidad de catalisis es menor,
constituia el paso mas lento y por lo tanto, ese paso es el que determina la velocidad total,
o flujo, a traves de toda la via. Para la glucolisis, la fosfofructoquinasa 1 (PFK-1) se
considero la enzima limitante de la velocidad, porque es una enzima ampliamente
regulada


Los invitamos a ver el video con la explicacion basica de la glucolisis
en el
siguiente link:
https://www.youtube.com/watch?v=UJZxqaYs4o4



Brizi Maria Cecilia-Gonzalez Y Rivas Melania Lilia-Mangialavori Irene Cecilia-Gonzalez De La Rosa Adys



Grupo Software educativo 1-AO1
Con el advenimiento de la ingenieria genetica, el sueno de poder obtener una gran
cantidad de producto (por ejemplo etanol, si pensamos en la glucolisis) parecia estar al
alcance de las manos, solo debiamos aumentar la velocidad del paso lento!
Como todos ustedes saben, la velocidad de una enzima puede aumentarse si
aumentamos su concentracion.


En el siguiente link pueden incursionar sobre los contenidos de Cinetica Basica:
http://www.uprm.edu/biology/profs/velez/modelo.htm


Por lo tanto, con todas las nuevas herramientas y conocimientos, los cientificos sobre-
expresaron la PFK-1 en levaduras para obtener grandes cantidades de producto.

Cita

(aca les agrego la cita).


Para su sorpresa, sobre-expresar 5 veces la cantidad de PFK-1 solo aumento la cantidad de
etanol en un 10%. (aca pueden ir iconos como menciona el manual de Melania).
Sin embargo, esta estrategia no fue un fracaso sino que permitio probar que "una
unica enzima no es determinante de la velocidad de una via" y por lo tanto, se refuto la
hipotesis de que mediante el aumento de la concentracion de dicha enzima, el flujo a
traves de la via aumenta proporcionalmente.





Parece que como ya hemos visto en muchas partes de
la biologia: Para un problema complejo hay siempre
una solucion simple (un solo paso determinante de la
velocidad de una via que incluye muchos) y esta suele

ser incorrecta



Ahora ha quedado claro para los cientificos que en la mayoria de las vias, el control del
flujo se distribuye entre varias enzimas, y la medida en que contribuye cada una al control
metabolico varia con las circunstancias del suministro del material de partida (por
ejemplo, glucosa), el suministro de oxigeno, la necesidad de otros productos derivados de
los compuestos intermedios de la via (por ejemplo, glucosa 6-fosfato para la via de las
pentosas fosfato en celulas que sintetizan grandes cantidades de nucleotidos), y el estado
hormonal de el organismo (los niveles de insulina y glucagon), entre los otros factores.
Brizi Maria Cecilia-Gonzalez Y Rivas Melania Lilia-Mangialavori Irene Cecilia-Gonzalez De La Rosa Adys



Grupo Software educativo 1-AO1

Por que estamos interesados en lo que limita el flujo de una via?

Para entender la accion de las hormonas o drogas, o la patologia que resulta de una falla
de la regulacion metabolica, debemos saber que control ejerce sobre el flujo cada
componente. Si los investigadores quieren desarrollar un farmaco que estimula o inhibe
una via, el objetivo logico es la enzima que tiene el mayor impacto en el flujo a traves de
esa via. Y la bioingenieria de un microorganismo para la sobreproduccion de un producto
comercial requiere el conocimiento de lo que limita el flujo hacia ese producto.
Ahora si, veamos como los cientificos lograron redireccionar las estrategias para
poder aumentar el flujo de una via metabolica.


Analisis del control metabolico

Empecemos con uno de los experimentos que da el puntapie inicial para el modelo de
analisis del control metabolico, conocido como MCA (del ingles Metabolic Control
Analysis
).
Cuando una muestra de higado de rata es homogeneizada para liberar todas las enzimas
solubles.

Hagamos memoria:

Que tipo de enzimas son las pertenecientes a la via glucolitica? En que
compartimiento celular se lleva a cabo la glucolisis?

El extracto convierte la glucosa en fructosa 1,6 bifosfato a una velocidad medible
experimentalmente (en este experimento, por simplicidad nos vamos a focalizar solo en la
primera parte de la via glucolitica).
Cuando se agregaron al extracto cantidades crecientes de hexoquinasa IV
purificada, el flujo glucolitico aumento progresivamente. La adicion de PFK-1 purificada al
extracto tambien aumento el flujo, pero no tan dramaticamente como lo hizo la
hexoquinasa IV. El agregado de fosfohexosa isomerasa purifica no tuvo efecto sobre el
flujo.

Que nos sugiere este experimento?

Nos sugiere que tanto la hexoquinasa IV como la PFK-1 influyen en el control del flujo
glucolitico (porque cuando aumentamos su cantidad el flujo aumenta), aunque la primera
lo hace en mayor medida que la segunda. La fosfohexosa isomerasa no tiene control sobre
el flujo de la via. Estas de acuerdo?
Brizi Maria Cecilia-Gonzalez Y Rivas Melania Lilia-Mangialavori Irene Cecilia-Gonzalez De La Rosa Adys



Grupo Software educativo 1-AO1
Tres parametros criticos, que en conjunto describen la capacidad de respuesta de
una via a los cambios en las circunstancias metabolicas, se encuentran en el centro de
MCA.





En esta clase nos vamos a focalizar solo en uno de ellos, la siguiente semana aprendemos
los dos restantes.
Empecemos ahora por una descripcion cualitativa de este parametro y su
significado en el contexto de una celula viva, y luego le daremos un analisis cuantitativo
mas riguroso al experimento que les muestro en la figura. Les parece bien?


El coeficiente de control de flujo de una enzima cuantifica el
control que esta ejerce sobre el flujo de dicha via.



Podemos obtener datos cuantitativos del experimento que vemos en la figura si
calculamos el "coeficiente de control de flujo" (CJ) para cada una de las enzimas de la via.
Este coeficiente expresa la contribucion relativa de cada enzima al flujo de la via.
Para una via lineal, como veremos en la clase, este parametro puede tomar valores
entre 0 y 1.


Como lo interpretamos?
Brizi Maria Cecilia-Gonzalez Y Rivas Melania Lilia-Mangialavori Irene Cecilia-Gonzalez De La Rosa Adys



Grupo Software educativo 1-AO1

Si el CJ de una enzima es "cero" significa que dicha enzima no contribuye nada (no ejerce
control, no?) en el flujo de la via. Mientras que si su CJ es 1, dicha enzima tendria el
control total sobre el flujo de esa via.
El CJ no es una constante, y no es una propiedad intrinseca de la enzima aislada,
sino que es una funcion de la totalidad sistema, es decir de todas las enzimas que
conforman la via, y su valor depende de la situacion metabolica en la que se encuentre el
sistema.

Una cosa mas...

La sumatoria de los CJ de todas las enzimas pertenecientes a una determinada via
metabolica es "1".
Esto ultimo se conoce como "teorema de aditividad", no vamos a ver su demostracion
pero pueden consultarla en el siguiente link.


Analisis del control metabolico
es.wikipedia.org/wiki/Analisis_del_control_metabolico





Para recordar:
Teorema de aditividad: La sumatoria de todos CJ de las
enzimas que conforman una via metabolica es igual a

la unidad.








Que podemos interpretar y/o deducir de lo ultimo que vimos?

1- Si una enzima tiene un CJ = 1, quiere decir que ella sola controla todo el flujo de la
via. Esto ultimo se parece a la hipotesis que vimos arriba que describe que, el flujo
se modifica solo a traves de "la enzima que ejerce el paso limitante", pero no
explica los resultados experimentales no les parece? Para MCA ninguna enzima
en una via tiene un CJ de 1 (todos los demas CJ deberian ser "cero" si esto
Brizi Maria Cecilia-Gonzalez Y Rivas Melania Lilia-Mangialavori Irene Cecilia-Gonzalez De La Rosa Adys



Grupo Software educativo 1-AO1
sucediera), por lo tanto, el control del flujo es compartido por todas las enzimas de
la via, aunque algunas tengan mas control que otras, por supuesto!)
2- Si una enzima de la via pierde control sobre el flujo (disminuye su CJ) en una
determinada situacion metabolica, otras enzimas deberan ganar control sobre el
flujo para que la sumatoria de los CJ sea igual a 1. Es decir, el teorema de
aditividad debe cumplirse en cualquier situacion.


Volvamos ahora al experimento de la figura:

Los investigadores determinaron que los CJ para las enzimas evaluadas fueron: 0.79 para la
Hexokinasa IV, 0.21 para la PFK1 y 0.0 para la isomerasa.

Que opinan? Les parece razonable este resultado? Coincide con lo que proponia la
hipotesis de "grado limitante"?

Ahora estamos listos para abordar los aspectos cuantitativos de MCA, que son los que nos
van a permitir predecir que enzima/s de la glucolisis deberiamos sobre-expresar en
levaduras para aumentar el flujo y asi poder obtener mas etanol.

Analisis de control metabolico: el aspecto cuantitativo

Empecemos por algunas definiciones que vamos a utilizar:


Fuente:
Es la cantidad de metabolito que ingresa a nuestra via. Su
concentracion es constante, por eso la consideramos una "fuente"
Sumidero: corresponde a una reaccion/ evento posterior a la que produce
el ultimo metabolito de nuestra via, de manera que su acumulacion no
interfiere en las reacciones de nuestro sistema.


Supongamos que queremos obtener etanol en exceso, al producirse una gran cantidad de
este, el flujo de la via cesaria por la acumulacion de producto, y no queremos eso! Por lo
tanto, para que la estrategia llegue a buen puerto debemos sacarlo del sistema, es decir,
el etanol iria a un sumidero.

Recurso web

(poner link con cinetica basica)
Comentario [a2]: va el mismo link de

arriba?


Ahora si, podemos definir nuestro sistema en forma general:
Brizi Maria Cecilia-Gonzalez Y Rivas Melania Lilia-Mangialavori Irene Cecilia-Gonzalez De La Rosa Adys



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E1
E2
E3
E4

A1 A2 A3 A4 A5
Figura Nro. 1


En nuestro sistema (recuadro punteado) hipotetico A1 es la fuente, es decir el primer
metabolito que ingresa al sistema y cuya concentracion es constante. A2, A3 y A4 son
metabolitos intermediarios de nuestra via, A5 es nuestro producto final (y sumidero) y E1,
E2 y E3, son las enzimas de la via a las que les vamos a determinar el CJ, para disenar
nuestra estrategia.
Cual podria ser nuestro sistema real a partir de este sistema general e hipotetico?
Si pensamos en la glucolisis, A1 podria ser glucosa (como suele ser nuestra concentracion
de glucosa?). E1-E3 y A2-A4 son las 3 primeras enzimas de la via y sus respectivos
sustratos y productos (podemos volver a poner el link de glucolisis). Para simplificar
nuestro sistema, como en el caso de la figura Nro. 1, E4 representa las 6 enzimas restantes
de la via glucolitica de tal manera que el etanol es nuestro producto final (A5).

Como definimos el CJ?

J

J
J
C
=
ei
ei
ei
ei

J
J
J

C
C
=
=

ei
ei
J
ei

Figura Nro. 2
El CJ de la enzima ei se define como la pendiente de la recta tangente en un punto de la
curva del flujo (J) de la via en funcion de la concentracion de la enzima ei.

Lo traducimos?
Volvamos sobre la figura Nro.1 y el experimento que se nos muestra en ella.
Focalicemonos en la curva de la PFK-1, por ejemplo. Si miramos como varia el flujo de la
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