Report - British Endocrine Society Summer Studentship

Professor Deborah Power, Comparative and Molecular Endocrinology group, CCMAR 2009 Universidade do Algarve Report – Society for Endocrinology 2009  Summer Studentship The reasons for the choice of student The studentship was awarded to the Comparative and Molecular Endocrinology Group which is located  in  the  Universidade  do  Algarve  which  has  recently  developed  the  area  of  Biomedicine and  Medicine.  The  objective  of  the  studentship  was  to  stimulate  interest  in  the  area  of Endocrinology.  For  this  reason  an  advertisement  was  prepared  which  was  placed  on  the University webpage and circulated to other Universities. Three applications were received and the  best  ranked  student,  based  on  the  results  of  their  undergraduate  course  was  offered  the position.  The  student  selected  was  completing  the  3  year  degree  in  Biomedicine  at  the Universidade  do  Algarve  and  was  called  Emanuel  Esgaio  (average  mark  17/20  (equivalent  to  a first class degree).   The aims of the project Recently  a  family  of  cellular  transporters,  the  organic  anion‐transporting  polypeptide  (OATP) family  and  monocarboxylate  transporter  (MCT)  family  which  regulate  cellular  TH  uptake  and efflux  were  identified  in  mammals.    The  scientific  objectives  of  the  present  study  were:  1) explore if TH cellular transporters exist in other vertebrates using in silico approaches, 2) clone TH cellular transporters and establish the kinetics of TH transport in teleosts and 3) determine the  tissue  distribution  of  transcripts  for  TH  transporters  and  how  their  expression  is  modified during  TH driven post‐embryonic development of  teleosts. The  training objectives included: 1) tutoring  of  the  appointed  student  in  endocrinology  focusing  on  the  thyroid  axis,  2)  provide laboratory  training  in  the  area  of  bioinformatics,  molecular  biology  and  biochemistry  and  3) provide training in presentation skills. Description of work The  model  chosen  for  the  study  was  the  zebrafish  (Danio  rerio)  which  has  a  well  defined  TH driven larval to juvenile transition. The zebrafish has numerous molecular resources and in silico database  searches  will  be  used  to  identify  monocarboxylate  transporter  8  (MCT8)  and  10 (MCT10)  which  are  both  specific  TH  transporters  in  humans.  If  cellular  transporters  of  TH  are identified in zebrafish the in silico analysis will be extended to other teleost fish and vertebrates. Phylogenetic  studies  will  be  carried  out  to  establish  the  evolutionary  relationship  between MCT8 and 10 and gene structure and linkage analysis in zebrafish will contribute to this analysis. If available MCT8 and MCT10 cDNA will be obtained from zebrafish cDNA collection and cloned into an  expression vector  and used to  transfect CHO cells and study  the kinetics of TH uptake and release using radiotracers for T3 and T4 (5 weeks). RT‐PCR of MCT8 and MCT10 will be used to evaluate transcript distribution in a  range of adult tissue  (brain, skin, kidney, muscle, bone, liver,  gills)  and  also  to  establish  if  changes  in  tissue  distribution  are  associated  with  tissue maturation during the larval/juvenile transition (3 weeks). If feasible quantitative RT‐PCR will be developed  to  permit  quantification  of  MCT8  and  10  and  also  for  future  experimental  studies ongoing in the host laboratory. Assessment of results and outcomes of studentship In silico searches in public databases retrieved  MCT8 from zebrafish, stickleback (Gasterosteus aculeatus)  and  Chinese  rare  minnow  (Gobiocypris  rarus)  and  MCT10  from  zebrafish,  catfish, medaka  (Oryzias  latipes),  Atlantic  salmon  (Salmo  salar)  and  fathead  minnow  (Pimephales promelas).  MCT8  and  MCT10  share  respectively,  49%  and  73%  similarity  with  the  human homologue.  Phylogenetic  analysis  using  MCT1,  MCT5,  MCT8  and  MCT10  from  all  vertebrates’ sequences  deposited  in  public  databases  revealed  the  different  forms  of  MCT  clustered  in Professor Deborah Power, Comparative and Molecular Endocrinology group, CCMAR 2009 Universidade do Algarve distinct  groups  and  the  tree  branching  indicated  MCT8  and  10  probably  shared  an  ancestral gene.  Comparison  of  the  gene  organization  of  MCT10  in  human  and  teleost  revealed  it  is conserved although the gene is 135kb in human and 19.8kb in teleosts as a result of differences in  the  intron  size.  MCT8  also  shared  a  conserved  gene  organization  between  teleosts  and humans and was also much bigger in human. The tissue distribution of MCT8 and 10 was more restricted in the zebrafish than the human and transcripts of the former gene were detected in liver, heart and brain, while the latter gene was detected in liver only.  A clone for the full length transcript was obtained and MCT8 and 10 cloned into the expression vector  pcDNA3.1/V5‐His‐TOPO  (Invitrogen)  and  verified  by  RT‐PCR  and  sequencing.  Adherent epithelial  cells  (HEK‐293,  Sigma‐Aldrich)  were  transfected  with  the  expression  vectors  and several  stable  cell  lines  produced  for  each  cloned  transcript.  It  was  not  possible  in  the  time frame  of  the  studentship  to  carry  out  the  evaluation  of  TH  transporting  activity  as  a consequence of some technical problems associated with cloning of inserts into the expression vector. Scientific training involved daily lab meetings and supervision of work by senior scientists in the host  laboratory.  Weekly  meetings  provided  the  opportunity  for  tutorials  about  the  endocrine system  and  the  thyroid  axis  in  general.  The  student  gave  two  oral  presentation  of  his  work during  laboratory  meetings  and  submitted  an  abstract  and  was  selected  for  a  poster presentation at the Iberian meeting of comparative Endocrinology (September 2009). The  overall  outcome  of  the  project  was  excellent:  1)  the  results  will  form  the  basis  of  a publication; 2) the student advanced their knowledge about endocrinology and their capacities in the area of molecular biology; 3) the studentship elicited interest within the University in the Department of Biomedicine and Medicine and 4) the studentship and its outcome were divulged at the meeting of Iberian Comparative Endocrinologists.  Future directions in which the project could be taken The work will be continued in order to carry out the functional characterisation of teleost MCT8 and MCT10. The work will form the basis of a project proposal to investigate the role of cellular TH  transporters  in  controlling  differential  responsiveness  of  tissue  organs  during  fish metamorphosis.  Departures from original proposal On the whole the planned work was carried out and MCT8 and MCT10 which were identified in teleosts and they were selected for analysis and to determine if they are functional homologues of  the  forms  found  in  humans.  Additional  work  included  the  characterisation  of  MCT8  and MCT10 gene organisation and linkage analysis. It was not possible to characterise the functional characteristics of the cell transporters because insufficient time was available.  Value of studentship to the student and to the lab The  studentship  has  heightened  the  visibility  of  the  host  laboratory  in  the  Universidade  do Algarve  and  drawn  attention  to  the  area  of  Endocrinology  which  is  largely  overlooked  by  the Biomedicine  and  medicine  degrees.  The  work  executed  by  the  student  allowed  a  speculative project to be carried out and the positive results will “pump prime” a project application. The inclusion  of  a  students  in  the  host  laboratory  stimulated  training  activities  an  interest  in including more students for short‐term training activities in the future. Details of any publications resulting from the grant The work formed the basis of the student’s final thesis for his degree an resulted in a 30 page report (in Portuguese).  See Annex I for the abstract accepted for the Vth meeting of the Iberian Association for Comparative Endocrinologists.  A publication is in preparation. Professor Deborah Power, Comparative and Molecular Endocrinology group, CCMAR 2009 Universidade do Algarve   Annex I Abstract for the Vth meeting of the Iberian Association for Comparative Endocrinology, Porto, September 2009   Thyroid hormone cell transporters: Do they exist in fish? Emanuel Esgaio, João CR Cardoso & Deborah M Power Comparative Molecular Endocrinology, Centre of Marine Sciences, Universidade do Algarve, 8005‐139 Faro   The T3 (Triiodothyronine) and T4 (Thyroxine) are important vertebrate thyroid hormones (TH) produced by the follicular cells and involved in many physiological functions, such as growth and development. They bring about their action by binding to nuclear thyroid receptors (TRs) by modulating gene expression and despite their lipophilic nature, T3 and T4 actions have recently been associated with the existence of highly specific membrane cell transporters. In humans, three transporters: MCT8 and MCT10 (monocarboxylate transporters) and the OATP1C1 (an organic anion‐transporting polypeptide) have been identified and an unbalance of T3 and T4 transport by these receptors was associated with the development of important human syndromes. Despite their functional importance their mechanism/regulation of action are poorly understood and evidences of their existence in other vertebrates such as teleosts, a basal vertebrate group is scarce. The aim of the present study was to characterise the fish thyroid hormones transporters using a series of in silico and functional approaches and to compare the homologue system with human. Data mining the teleost EST and genome databases with the human homologues identified a single MCT8 and MCT10 genes and in silico comparisons revealed they are highly similar and share an identical gene organisation with the human gene and are composed by 6 coding exons but are at least 10 times smaller. Tissue expression indicates the zebrafish transporters have a similar distribution with the humans and were found in liver, brain and heart, suggesting similar functions. Currently mammalian cell assays are under development and their role in the T3 and T4 transport will be further elucidated. Acknowledgments: EE was funded by a summer studentship from the British Endocrine Society. The work was supported by CCMAR Pluriannual project.