Mecanismos implicados en la regulacion
de la expresion de genes mitocondriales
por PGC-1 en tejido adiposo blanco
Trabajo de investigacion. Master en Biomedicina U.B.

Victor Manuel Lopez Alvarez
2012

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Mecanismos implicados en la regulacion de la expresion de genes mitocondriales por PGC-1 en tejido adiposo blanco
2012



MECANISMOS IMPLICADOS EN LA REGULACION DE
LA EXPRESION DE GENES MITOCONDRIALES POR
PGC-1 EN TEJIDO ADIPOSO BLANCO


Memoria presentada por
Victor Manuel Lopez Alvarez

para optar al grado de Master en Biomedicna
Trabajo realizado en el grupo de M etabolismo y Obesidad del Instiut de
Investigacion del Hospital Universitario Val d'Hebron (VHIR), bajo la direcion del
Dr. Josep Antoni Villena Delgado.





Dr. Josep Antoni Villena Delgado Victor Manuel Lopez Alvarez
Barcelona, Julio 2012
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Mecanismos implicados en la regulacion de la expresion de genes mitocondriales por PGC-1 en tejido adiposo blanco
2012

INDICE
* Introduccion________________________________________________________________Pag. 4.
Fisiologia del tejido adiposo
Biogenesis mitocondrial en tejido adiposo blanco
* Objetivo_____________________________________________________________________Pag. 9.
* Materiales y metodos____________________________________________________Pag. 10.
Celulas 3T3-L1 como modelo celular de tejido adiposo blanco
Generacion de virus recombinantes para transduccion de 3T3-L1
Generacion de vectores lanzadera con ADN de interes
Silenciamiento y sobreexpresion en celulas 3T3-L1
Obtencion y analisis de ARN, proteinas y cDNA
* Resultados_________________________________________________________________Pag. 17.

Analisis de expresion proteica a diferentes MOIs
Knockdown de ERRs y sobreexpresion de PGCs
Knockdown de NRFs y sobreexpresion de PGCs
* Discusion__________________________________________________________________Pag. 23.
* Conclusiones______________________________________________________________Pag. 24.
* Bibliografia________________________________________________________________Pag. 25.





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Mecanismos implicados en la regulacion de la expresion de genes mitocondriales por PGC-1 en tejido adiposo blanco
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INTRODUCCION
Fisiologia del tejido adiposo
Tejido adiposo blanco
Las funciones principales del tejido adiposo blanco son, el almacenaje energetico en forma de
trigliceridos en las gotas lipidicas de los adipocitos y su amplio papel como organo endocrino. Cuando
existe un exceso calorico, el tejido adiposo blanco acumula carbohidratos y lipidos en forma de
trigliceridos que se liberaran bajo un deficit energetico en forma de acidos grasos y glicerol. El tejido
adiposo responde a numerosos estimulos hormonales externos como: la insulina, el cortisol, las
catecolaminas...y tambien a diferentes citoquinas. No solo recibe estimulos, sino que tambien secreta
adipoquinas, implicadas en numerosos procesos reguladores de la homeostasis energetica (adipsina,
leptina, resistina, TNF...). De este modo, posee una funcion endocrina que tiene efectos reguladores
sobre reproduccion, metabolismo de la glucosa, peso corporal, etc...
Tejido adiposo marron
Ademas del tejido adiposo blanco, en mamiferos existe un segundo tipo de tejido adiposo llamado
tejido adiposo marron. Esta especializado en producir termogenesis ante situaciones de bajas
temperaturas que afectan a los organismos homeotermos. Anteriormente en humanos, solo se creia
presente en neonatos, pero recientemente (Cypess, 2009) se ha demostrado tambien la presencia de
este tejido en el humano adulto.
Morfologicamente se distingue del tejido adiposo blanco en que sus adipocitos poseen gotas lipidicas
mucho mas pequenas y abundantes. Ademas, tienen un gran numero de mitocondrias por celula, lo cual
les confiere ese color pardo. El porque de tantas mitocondrias, se explica con su funcion, ya que estas
poseen una proteina clave en la generacion de esa termogenesis celular, la UCP-1 (Uncoupling protein 1)
la cual permite el desacoplamiento de la cadena respiratoria mitocondrial con la consecuente
generacion continua de calor.
Tejido adiposo, resistencia a la insulina y diabetes
Tanto un defecto (lipodistrofia) como un exceso (obesidad) de tejido adiposo blanco, puede ser
perjudicial para la salud y provocar numerosas alteraciones metabolicas que desemboquen muchas
veces en resistencia a la insulina, diabetes tipo 2 (Mora, 2002; Fischer-Posovszky, 2007; Moreno, 2002;
Faraj, 2004) o enfermedades cardiovasculares.
La resistencia a la insulina se produce cuando los lipidos se estan acumulando en tejidos insulino-
sensibles que tienen una capacidad reducida de almacenaje. Estos acumulos lipidicos provocan la
desregulacion de la cascada senalizadora de la insulina a traves de la activacion diversas quinasas. En
lipodistrofias congenitas o adquiridas, los adipocitos son pocos y mas pequenos de lo habitual y con el o
la capacidad de almacenaje de trigliceridos se ve muy reducida, aumentando asi la presencia de estos en
el torrente sanguineo y la consiguiente acumulacion en otros tejidos.
La otra explicacion, y mas habitual en nuestra sociedad actual, es la obesidad. Cuando la obesidad se
agudiza y hay una sobrecarga de grasas en la dieta, los adipocitos adquieren gran tamano y entran en un
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estado inflamatorio en el que se reclutan macrofagos debido a la secrecion de quimioatrayentes como
el MCP-1 (Monocyte Chemoattractant Protein-1). Los macrofagos infiltrados en el tejido adiposo
secretaran grandes cantidades de TNFy otras citoquinas proinflamatorias que desencadenara un
estado inflamatorio causante de la resistencia a la insulina. En obesos en lo que se ve muy aumentada la
masa de tejido adiposo blanco, se ve sobrepasada la capacidad de almacenamiento de mas lipidos por
parte de los adipocitos que ya han alcanzado un gran tamano. El o tambien supondra una mayor
presencia de lipidos en la circulacion sanguinea.
Gran numero de lipidos activados (Acil-CoAs, diacilgliceroles o ceramidas) se acumulan en otros tejidos
como el higado o los musculos debido a la gran abundancia de trigliceridos y acidos grasos libres
presentes en la sangre. Una tercera hipotesis seria que las disfunciones mitocondriales provocan que no
se oxiden adecuadamente los lipidos que llegan al organo y estos se acumulen provocando resistencia a
la insulina (Guilherme, 2008) por los mecanismos anteriormente descritos.
Por lo tanto, defectos en la diferenciacion a adipocitos maduros, o en la funcion endocrina y de
almacenaje del tejido adiposo, hace que no se puedan acumular mas lipidos tras su ingesta en la dieta y
aumente mucho la presencia de estos en la circulacion acumulandose en tejidos que no tienen
capacidad suficiente para almacenarlos. Como se ha descrito anteriormente, un mal funcionamiento del
tejido adiposo tambien provoca un desajuste en la homeostasis glucidica del organismo provocando
resistencia a la insulina la cual puede derivar posteriormente en diabetes tipo 2.
Biogenesis mitocondrial en el tejido adiposo blanco
Como se ha mencionado antes, alteraciones en la funcion mitocondrial pueden ser la causa del
desarrollo de resistencia a insulina y el posterior desarrollo de diabetes tipo 2. El tejido adiposo blanco,
no es particularmente rico en mitocondrias. Sin embargo, la biogenesis y la actividad mitocondrial en el
tejido adiposo blanco responden en gran medida a senales fisiologicas. Estas son suprimidas en modelos
animales de diabetes y obesidad inducida por la dieta y son promovidas por tratamientos con ligandos
insulino-sensibilizantes de PPAR (Peroxisome Proliferator-Activator Receptor). El tratamiento con
Tiazolidinedionas (TZDs) aumenta la adipogenesis desencadenando en una disimnucion de los lipidos
circulantes y consecuentemente, una mejora en la sensibilidad a la insulina.
Tambien se ha observado que el tratamiento con TZDs incrementa la biogenesis mitocondrial en tejido
adiposo blanco en humanos (Bogacka, 2005). El o ha llevado a hipotetizar que el aumento de masa
mitocondrial provocado por el tratamiento con TZDs contribuye de forma importante a la mejora de la
resistencia a la insulina. La capacidad de los agonistas de PPAR de promover la biogenesis mitocondrial
en adipocitos in vitro, sugiere que los efectos son debidos a una funcion celular autonoma de PPAR en
tejido adiposo blanco y no debidos a una respuesta a cambios sistemicos causados por ligandos de
PPAR en otros tejidos.
En estos estudios, los agonistas de PPAR indujeron la expresion de PGC1- endogeno, sugiriendo que
PPAR afecta a la biogenesis mitocondrial indirectamente promoviendo la transcripcion de PGC1-.
Estos estudios sugieren que los cambios en la biogenesis mitocondrial del tejido adiposo blanco podrian
estar detras de las patologias asociadas a la diabetes o de la mejora del control glucemico inducido por
las TZDs. El incremento de la actividad mitocondrial podria mejorar los sintomas de la enfermedad
metabolica mediante el incremento del gasto energetico y/o la sintesis de adipoquinas (Hock, 2009).


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Figura 1: Esquema de la red transcripcional que controla la expresion de genes mitocondriales (Hock, 2009).

Regulacion de biogenesis mitocondrial
Los coactivadores PGC-1 (Peroxisome Proliferator-Activator Receptor gamma 1) y PGC-1
(Peroxisome Proliferator-Activator Receptor gamma 1) juegan papeles importantes en el control de la
biogenesis y funcion mitocondrial mediante la integracion de senales fisiologicas y coordinadamente
promueven la funcion de varios factores de transcripcion que actuan sobre los genes mitocondriales.
PGC-1 se identifico por primera vez como una proteina que interactuaba con PPAR, que se expresaba
selectivamente en tejido adiposo marron, y se inducia por la exposicion al frio. Mas tarde, en base a su
similitud con PGC1-, se identificaron PGC-1 y PRC. Los tres coactivadores regulan la expresion de un
amplio grupo de genes mitocondriales y promueven la biogenesis mitocondrial en una variedad de
tejidos como musculo esqueletico y cardiaco, cerebro, higado o tejido adiposo marron.
Las proteinas PGC-1 comparten tres rasgos moleculares que son importantes para la regulacion de
genes mitocondriales. Primero, tienen superficies que permiten la interaccion con los NRFs, PPAR, ERRS
y YY1, y son de esta forma reclutados en lugares reguladores diana. Segundo, las tres proteinas PGC-1
comparten dominios de activacion transcripcional similares que permiten un incremento en la expresion
genica. Finalmente, las proteinas PGC-1 tienen lugares de modificaciones postraduccionales o
interaccion con proteinas reguladoras.
Asi, el modo de accion de PGC-1 sobre los genes mitocondriales parece ser muy simple. PGC-1 se acopla
a los factores de transcripcion que coactiva permitiendo el reclutamiento de histonas y el complejo
mediador, promoviendo asi la iniciacion y/o elongacion transcripcional (Hock, 2009).
PGC-1 y PGC-1 inducen programas similares pero no identicos. La expresion de PGC-1, y no PGC-1,
esta regulada positivamente en el tejido adiposo marron en respuesta al frio u exceso calorico. Los
experimentos de ayuno muestran que PGC-1, pero no PGC-1, se induce en el higado y esto sugiere
que solo PGC-1 esta involucrado en la gluconeogenesis hepatica. No se han observado cambios en la
expresion de PGC-1 asociados al ejercicio en musculo. Esto sugiere que PGC-1 podria jugar un papel
constitutivo en la biogenesis mitocondrial independiente de la estimulacion adrenergica (Meirghaeghe,
2003). Un aspecto a tener en cuenta es que en animales donde falta solamente PGC-1 o PGC-1, los
defectos mitocondriales son muy suaves. Esto podria estar debido a que PGC-1 y PGC-1 se
compensan mutuamente in vivo (Lel iott, 2006), (Vianna, 2006), (Sonoda, 2006).
El papel de PGCs en el tejido adiposo blanco es practicamente desconocido. Como se ha descrito
previamente en nuestro laboratorio (Pardo, 2011), en el tejido adiposo blanco PGC-1 es prescindible
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para la biogenesis basal o inducida por rosiglitazona (TZD) pero necesario para la expresion inducida por
rosiglitazona de UCP1 y otros marcadores especificos de adipocitos marrones. Por lo tanto PGC-1 es
importante para la aparicion de adipocitos marrones en el tejido adiposo blanco. Tambien se observo
que la falta de PGC-1 no desencadena en resistencia a insulina. Actualmente en nuestro laboratorio
estamos trabajando en la hipotesis de que PGC-1 y no PGC-1 regula la expresion de genes
mitocondriales tanto de manera basal como inducida por rosiglitazona (TZD) en adipocitos blancos
(Enguix et al., unpublished data). Los resultados preliminares demuestran que PGC-1 regula la
expresion en tejido adiposo blanco y en adipocitos en cultivo, de genes mitocondriales del sistema
oxphos y del ciclo de Krebs. Sin embargo, sin embargo desconocemos los mecanismos a traves de los
cuales PGC-1 ejerce su funcion.
Sabemos que PGC-1 tiene una funcion en tejido adiposo pero queremos conocer los mecanismos de
actuacion que tiene como coactivador, y determinar cuales son los factores de transcripcion que median
los efectos de PGC-1 en genes mitocondriales. Estudios anteriores muestran evidencias claras acerca
de dos familias candidatas como son los ERRs y NRFs.
La familia ERR
Son receptores nucleares huerfanos. Existen 3 subtipos: ERR, ERR y ERR.
El ERR fue el primero en identificarse (Giguere, 1988). ERR y tienen una amplia distribucion aunque
mayoritariamente se localiza en organos muy oxidativos que utilizan acidos grasos libres como fuente de
energia como: el higado, el cerebelo, el corazon, el intestino y el musculo esqueletico.
Estan principalmente envueltos en la regulacion transcripcional de genes de biogenesis mitocondrial,
gluconeogenesis, metabolismo de acidos grasos y fosforilacion oxidativa. Los animales que tienen esta
proteina ausente presentan defectos en el metabolismo y absorcion de grasas y se ven afectados
notablemente cuando se tratan con estimulos como la exposicion al frio, sobrecarga cardiaca o una
infeccion que requieren un "cambio de engranaje" en el metabolismo energetico (Vil ena, 2006, Huss
2006, Sonoda, 2006)
Se ha demostrado que ERR necesita de la coactivacion por parte de PGC-1 para actuar, pero esto no
se ha determinado con seguridad para PGC-1 en tejido adiposo blanco y en el o centraremos nuestros
esfuerzos.
La familia NRF
NRF1 (Nuclear Respiratory Factor 1) codifica una proteina que homodimeriza y funciona como un factor
de transcripcion que activa la expresion de genes metabolicos y es clave regulando el crecimiento
celular y otros genes nucleares requeridos para la respiracion, biosintesis del grupo hemo.
NRF2 esta formado por dos subunidades: GABP y GABP (subunidad reguladora) y su funcion en la
regulacion de la expresion de genes oxphos es ampliamente conocida (Virbasius, 1993), (Vil ena, 1994).
Como se ha visto con ERR, NRF1 y NRF2 tambien interactuan directamente con PGC-1 para regular la
expresion genica. Para nosotros NRF2 sera tambien otro target de estudio en relacion a la coactivacion
por PGC-1.


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OBJETIVO
El objetivo a largo plazo es estudiar el papel de PGC-1 en el tejido adiposo blanco y su implicacion en
obesidad y diabetes tipo 2. Con esta finalidad se describio el siguiente objetivo para el siguiente trabajo:
Conocer los mecanismos de PGC-1 en la regulacion de la biogenesis mitocondrial en el tejido adiposo
blanco determinando que factores de transcripcion son los que median los efectos de PGC-1 sobre la
expresion de genes mitocondriales.






















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MATERIALES Y METODOS
Celulas 3T3-L1 como modelo celular de tejido adiposo blanco
Linea celular establecida a partir de celulas MEF (Mouse Embryonic Fibroblasts). Aisladas a partir de un
clon por Green y col. en 1974.
Sobre este modelo celular he realizado todos mis experimentos in vitro basados en adipocitos maduros.
Estas celulas tienen capacidad diferenciadora al alcanzar la confluencia si son tratadas con un coctel
hormonal adecuado, en nuestro caso; dexametasona, IBMX (Isobutilmetilxantina) e insulina. Fueron
cultivadas en placas de plastico tratado e incubadas a 37C, 95% de humedad y 5% de Co2.
Division y subcultivo
Consiste en separar las celulas de la superficie de cultivo mediante un enzima proteolitico (tripsina en
nuestro caso), y posterior siembra de las celulas en nuevas placas a la concentracion pertinente en cada
caso.
1. Aspiramos el medio de proliferacion (DMEM (Dulbeco Modied Eagle's Medium) +10% NCS
(Newborn Calf Serum) + antibioticos-antimicoticos (Penicilina 100 U/ml, Estreptomicina 100
g/mL y Amfotericina 0,25 g/mL)) y lavamos las celulas con PBS (Phosphate Buffered Saline pH
7,4) para eliminar restos de medio y maximizar la eficiencia de la tripsina.
2. Anadimos tripsina (0,5 ml por placa de 10 cm O), la distribuimos y retiramos el exceso.
3. Incubamos 2-3 minutos hasta que las celulas se despeguen de la superficie.
4. Anadimos 10 ml de medio de proliferacion y resuspendemos las celulas con la pipeta.
5. Anadimos medio a la placa nueva en la proporcion deseada para mantener nuestro stock
celular (7,5 ml para una dilucion 1/4).
6. Sembramos las celulas resuspendidas previamente (200.000 celulas por placa).
Diferenciacion
Las celulas tienen caracteristicas preadipocitarias con morfologia de fibroblastos cuando las
mantenemos en medio de proliferacion hasta que alcanzan la confluencia en placa. Dos dias despues de
alcanzar la confluencia se las induce a diferenciacion adipocitaria con medio que contiene: DMEM+10%
FBS (Fetal Bovine Serum) + antibioticos-antimicoticos + Insulina 100 nM + Dexametasona 1 M + IBMX
0,5 mM durante dos dias. A continuacion se cultivan con medio de diferenciacion (DMEM+10% FBS +
antibioticos-antimicoticos + Insulina 100 nM. Este se renovara cada dos dias hasta su total maduracion.
La temporalidad es la siguiente:



Figura 2: Representacion de los eventos claves en la diferenciacion adipocitaria
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Generacion de virus recombinantes para transduccion de celulas 3T3-L1
En nuestro caso, hemos utilizado adenovirus del serotipo 5 como vector ya que nuestras celulas de
estudio (3T3-L1) no se transfectan bien con plasmidos.
Para la generacion de adenovirus reconmbinantes se necesita aislar tanto el ADN del vector virico 5
(adenovirus modificado) como nuestro plasmido con el fragmento de interes. Estos se cotransfectaran
con PEI en celulas Cre8 cuyo genoma celular modificado permitira la recombinacion de ambos ADNs y la
generacion de particulas viricas con capside funcional y capacidad infectiva.
La generacion del virus 5 se hace en celulas HEK (Human Embryonic Kidney) 293 A. Estas, son celulas
aisladas en los 70 por el grupo del doctor Van der Eb, del rinon de un feto humano sano. La variedad 293
A es la mas adherente. Estas celulas se mantienen en estado proliferativo con un medio DMEM +
Glutamax suplementado con 10% de FBS y antibioticos y antimicoticos.
Aislamiento de ADN de adenovirus 5
1. Crecimiento de celulas 293 A con DMEM + Glutamax suplementado con 10 % FBS y antibioticos
y antimicoticos, en 8 placas de 15 cm O hasta el 95% de confluencia
2. Infeccion de celulas con 50 l de adenovirus 5
3. Incubar a 37C hasta que presenten efectos citopaticos (aproximadamente 48 h)
4. Recoger las celulas cuando comiencen a despegarse de la placa y centrifugar a 1.500 rpm
durante 10 min. Resuspender el precipitado celular con 10 ml de medio fresco
5. Congelar rapidamente en etanol con hielo seco (-80C) y realizar 3 ciclos de congelacion y
descongelacion (bano de 37 C) para lisar las celulas y liberar las particulas viricas.
6. Centrifugar a 4 C y 4.000 rpm durante 10 min y recuperar el sobrenadante
7. Anadimos 0,5 g de CsCl por ml de lisado y lo transferimos a un tubo de ultracentrifuga que
sel aremos y centrifugaremos a 35.000 rpm a 4 C durante 16 h. El rotor se detendra sin freno
8. Recuperar la bandas bandas viricas (de virus empaquetado y virus no funcional, ya que ambos
poseen ADN virico) con una jeringuilla
9. Dializar los virus durante 16 h con buffer TE (Tris con HCl y EDTA) y membrana de 25 kDa
10. Colectar el virus dializado y digerir con proteinasa K durante 1h a 37 C
11. Extraer ADN con fenol/cloroformo
12. Precipitar ADN
13. Centrifugar a 12.000 rpm durante 15 min y lavar el precipitado 2 veces con etanol 70 %
14. Secar el precipitado y resuspenderlo a continuacion con buffer TE
15. Cuantificacion y comprobacion de la integridad en gel de agarosa al 0,7% (banda de ADN virico
alrededor de las 30 Kb)
Generacion de vectores lanzadera con ADN de interes
Los adenovirus que expresan nuestra proteina de interes se genran mediante la recombinacion entre
adenovirus 5 y el vector lanzadera pAdLox (plasmido portador del fragmento de interes), gracias a la
presencia en ambos vectores de sitios LoxP que son reconocidas por la recombinasa Cre. Para realizar
mis experimentos de sobreexpresion en celulas 3T3-L1 necesitaba varios virus recombinantes. Los que
he utilizado son: pAdLox-2xflag-PGC-1 y pAdLox-2xflag-PGC-1. Estos ya estaban preparados pero yo
he colaborado en la generacion de dos vectores mas:
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• Memoria presentada por
• Vctor Manuel L᭳pez lvarez
• Fisiologma del tejido adiposo
• Tejido adiposo blanco
• Las funciones principales del tejido adiposo blanco son, el almacenaje energtico en forma de triglicridos en las gotas lip驭dicas de los adipocitos y su amplio papel como rgano endocrino. Cuando existe un exceso calrico, el tejido adiposo blanco ac...
• Tejido adiposo marr㳳n
• Adems del tejido adiposo blanco, en mamferos existe un segundo tipo de tejido adiposo llamado tejido adiposo marr᭳n. Est especializado en producir termognesis ante situaciones de bajas temperaturas que afectan a los organismos homeotermos. Anterio...
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• La otra explicaci㱳n, y ms habitual en nuestra sociedad actual, es la obesidad. Cuando la obesidad se agudiza y hay una sobrecarga de grasas en la dieta, los adipocitos adquieren gran tamao y entran en un estado inflamatorio en el que se reclutan mac...
• Gran nᱺmero de lpidos activados (Acil-CoAs, diacilgliceroles o ceramidas) se acumulan en otros tejidos como el hgado o los m�sculos debido a la gran abundancia de triglicridos y cidos grasos libres presentes en la sangre. Una tercera hip顳tesis ser...
• Por lo tanto, defectos en la diferenciacin a adipocitos maduros, o en la funcin endocrina y de almacenaje del tejido adiposo, hace que no se puedan acumular m㳡s lpidos tras su ingesta en la dieta y aumente mucho la presencia de stos en la circula...
• MATERIALES Y M�TODOS
• Divisin y subcultivo
• Generacin de virus recombinantes para transducci㳳n de clulas 3T3-L1
• 龿
• Generacin de vectores lanzadera con ADN de inters
• 龿
• ෾
• Giguere, V., et al. (1988).Identification of a new class of steroid hormone receptors. Nature. 331(6151):91-4.
• Kilroy, et al. (2009). High efficiency lipid-based siRNA transfection of adipocytes in suspension. PLos One. 4(9):e6940
• ﾿
• Vianna, C.R., et al. (2006). Hypomorphic mutation of PGC-1beta causes mitochondrial dysfunction and liver insulin resistance. Cell Metab. 4(6):453-64.
• Villena, J.A., et al., (1994). ETS transcription factors regulate the expression of the gene for the human mitochondrial ATP synthase beta-subunit. J Biol Chem. 269(51):32649-54.
• Villena, J.A., et al. (2007). Orphan nuclear receptor estrogen-related receptor alpha is essential for adaptive thermogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 104(4):1418-23
• Virbasius, J.V., et al. (1991). Transcriptional activation through ETS domain binding sites in the cytochrome c oxidase subunit IV gene. Moll Cell Biol. 11(11):5631-8

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